产品货号：
TK0001
中文名称：
一步免提取RT-PCR试剂盒(探针法)
英文名称：
Sample Direct RT-qPCR Kit
产品规格：
25μl×200次|25μl×1000次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是采用探针法进行One-Step Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用时只需要加入检测目的基因所需的引物、探针及模板样品，即可快速开始反应。样品数量较多时，本制品可以直接以含有RNA病毒等的生物样品起始反应，无需进行RNA提取及纯化。由于核酸提取、反转录、qPCR各反应在同一反应管中连续进行，大大提高了操作简便性，减少了反应时间。从核酸提取（90℃）到反转录反应（55-65℃）连续进行，对于含有复杂高级结构的RNA病毒等的检测也能发挥作用。cDNA合成后进行高扩增效率的PCR反应，探针发出的荧光可实时检出。
对于重复检测特定目的基因等的实验，实验环境中常混有先前检测反应的扩增产物，本制品中含有能够分解带有dUTP的PCR产物的UNG酶（Uracil N-Glycosylase），持续使用本制品能够有效避免交叉污染造成的假阳性问题。
本制品对于肝素（血液）和腐殖酸（土壤）等各种阻害物质具有高耐受性，可用于从各种生物样品直接起始进行病毒及细菌检测，或基因的表达分析等应用。
试剂盒组成：
保存条件：-20℃
工作原理：
1．RT-PCR
RNA虽不能直接作为PCR的模板，但是通过使用反转录酶将RNA合成cDNA，就可以利用PCR对RNA进行分析。这就是RT-PCR，是高灵敏度的RNA检测方法。本制品使用One Step RT-PCR法，其原理如下图所示。One Step RT-PCR先使用PCR用特异性引物（Reverse）进行反转录反应，然后以合成的cDNA为模板，经特异性引物（Forward,Reverse）进行PCR扩增，整个反应在同一个反应管中连续进行。
2．荧光检出
寡核苷酸荧光探针在5'端带有荧光物质（如：FAM等），同时3'端带有淬灭物质（如：TAMRA，BHQ1等）修饰。退火条件下，探针与模板DNA特异性杂交，但是5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。在PCR反应的延伸过程中，DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，从而解除淬灭物质的制约，游离的荧光物质发出荧光。该过程中产生的荧光可以通过Real-Time PCR装置检出。这些原理组合形成的方法，可以对样品进行实时定量，被称为One Step RT-qPCR。
操作注意事项：
1．2×RT-qPCR MasterMix(UDG)室温融解后，轻轻混匀，并轻微离心将液体收集于管底。使用后，立即于-20℃保存。
2．分取试剂时请务必使用新的一次性枪头，以避免样品间的污染。
3．本制品只能使用特异性反转录引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer进行反转录反应。
4．制备RNA样品时，为防止实验者的汗液及唾液中含有的RNase的混入，操作过程中尽量不说话，同时佩戴一次性手套。
5．为使cDNA成功合成，需要尽量抑制样品中含有的RNase的作用，同时也要尽量避免使用的器具溶液等外部原因混入的RNase。
操作方法：
一、室温下配制反应液：
PCR反应管或反应板轻微离心后，放入Real Time PCR仪器中，按照下述条件开始反应。
注：
① 通常引物终浓度为0.2μM可以得到理想的结果，反应性能差时，可以在0.1～1.0μM的范围内调整引物浓度。
② 探针的浓度，随使用的Real Time PCR仪器的型号和探针的荧光标记物质不同而不同。请参考探针附带的说明书等信息研讨添加量。
③ 使用ROX Reference Dye，请参考下表：
④ 样品添加量在反应液总量的1/10以下，或10pg-1μg的添加范围内，能得到理想的结果。目的核酸浓度低时，样品添加量可以使用超过反应液总量1/10，但需注意可能会对RT-qPCR反应有阻害作用。
⑤ 按照各仪器的推荐量调整。
二、Real-Time RT-qPCR反应设置：
反应推荐按照下述的标准操作流程进行，也可根据需要优化PCR反应条件
注：
⑥ 怀疑有交叉污染时，进行该操作。通过UNG的作用，分解交叉污染的PCR（含dUTP）产物。
⑦ 此步骤是必要的，必须进行90℃ 3分钟或95℃ 30秒的变性。
⑧ 根据仪器不同，可能存在检出步骤不能设置在30秒以内的情况。此时，请按照该仪器能设定的秒数设置（31秒，34秒等）。
三、结果分析：
反应结束后确认扩增曲线，进行定量时制作标准曲线等，分析方法参见仪器的操作手册。
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对于重复检测特定目的基因等的实验，实验环境中常混有先前检测反应的扩增产物，本制品中含有能够分解带有dUTP的PCR产物的UNG酶（Uracil N-Glycosylase），持续使用本制品能够有效避免交叉污染造成的假阳性问题。
本制品对于肝素（血液）和腐殖酸（土壤）等各种阻害物质具有高耐受性，可用于从各种生物样品直接起始进行病毒及细菌检测，或基因的表达分析等应用。
试剂盒组成：
| 组分 | 规格(200T) |
| 2×RT-qPCR MasterMix(UDG) | 625μl×4 |
| RNase-Free H2O | 1.25ml×2 |
| ROX Reference Dye I（50X） | 100μl |
| ROX Reference Dye II（50X） | 100μl |
保存条件：-20℃
工作原理：
1．RT-PCR
RNA虽不能直接作为PCR的模板，但是通过使用反转录酶将RNA合成cDNA，就可以利用PCR对RNA进行分析。这就是RT-PCR，是高灵敏度的RNA检测方法。本制品使用One Step RT-PCR法，其原理如下图所示。One Step RT-PCR先使用PCR用特异性引物（Reverse）进行反转录反应，然后以合成的cDNA为模板，经特异性引物（Forward,Reverse）进行PCR扩增，整个反应在同一个反应管中连续进行。
2．荧光检出
寡核苷酸荧光探针在5'端带有荧光物质（如：FAM等），同时3'端带有淬灭物质（如：TAMRA，BHQ1等）修饰。退火条件下，探针与模板DNA特异性杂交，但是5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。在PCR反应的延伸过程中，DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，从而解除淬灭物质的制约，游离的荧光物质发出荧光。该过程中产生的荧光可以通过Real-Time PCR装置检出。这些原理组合形成的方法，可以对样品进行实时定量，被称为One Step RT-qPCR。
操作注意事项：
1．2×RT-qPCR MasterMix(UDG)室温融解后，轻轻混匀，并轻微离心将液体收集于管底。使用后，立即于-20℃保存。
2．分取试剂时请务必使用新的一次性枪头，以避免样品间的污染。
3．本制品只能使用特异性反转录引物，不能使用Random Primer和Oligo dT Primer进行反转录反应。
4．制备RNA样品时，为防止实验者的汗液及唾液中含有的RNase的混入，操作过程中尽量不说话，同时佩戴一次性手套。
5．为使cDNA成功合成，需要尽量抑制样品中含有的RNase的作用，同时也要尽量避免使用的器具溶液等外部原因混入的RNase。
操作方法：
一、室温下配制反应液：
| 成分 | 用量 | 终浓度 |
| 2×RT-qPCR MasterMix(UDG) | 12.5μl | 1× |
| PCR Forward Primer（10μM） | 0.5μl | 0.2μM① |
| PCR Reverse Primer（10μM） | 0.5μl | 0.2μM① |
| Probe（10μM） | 0.5μl | 0.2μM② |
| ROX Reference Dye or Dye（50X） | 0.25μl/不添加③ | 0.5×/0 |
| 样品 | ≤2.5μl④ | - |
| RNase Free H2O | up to 25μL⑤ | - |
PCR反应管或反应板轻微离心后，放入Real Time PCR仪器中，按照下述条件开始反应。
注：
① 通常引物终浓度为0.2μM可以得到理想的结果，反应性能差时，可以在0.1～1.0μM的范围内调整引物浓度。
② 探针的浓度，随使用的Real Time PCR仪器的型号和探针的荧光标记物质不同而不同。请参考探针附带的说明书等信息研讨添加量。
③ 使用ROX Reference Dye，请参考下表：
| ROX Reference Dye I | ROX Reference Dye II | 不添加 |
| ABI StepOnePlus | ABI7500 Fast | Bio-Rad CFX系列 Roche LightCycler系列 Thermal Cycler Dice Real Time System系列 |
④ 样品添加量在反应液总量的1/10以下，或10pg-1μg的添加范围内，能得到理想的结果。目的核酸浓度低时，样品添加量可以使用超过反应液总量1/10，但需注意可能会对RT-qPCR反应有阻害作用。
⑤ 按照各仪器的推荐量调整。
二、Real-Time RT-qPCR反应设置：
反应推荐按照下述的标准操作流程进行，也可根据需要优化PCR反应条件
| 温度 | 时间 | 循环数 | 说明 |
| 37℃ | 10min | 0或1⑥ | UNG酶解PCR产物污染 |
| 90℃ | 3min | 1⑦ | 核酸热提取 |
| 或95℃(95～98℃) | 30sec | ||
| 60℃(55～65℃) | 5min(2～5min) | 1 | 反转录 |
| 95℃(95-98℃) | 5sec(3～5sec) | 40 | 变性 |
| 60℃(55～65℃) | 30sec(15～35sec)⑧ | 退火/延伸 |
注：
⑥ 怀疑有交叉污染时，进行该操作。通过UNG的作用，分解交叉污染的PCR（含dUTP）产物。
⑦ 此步骤是必要的，必须进行90℃ 3分钟或95℃ 30秒的变性。
⑧ 根据仪器不同，可能存在检出步骤不能设置在30秒以内的情况。此时，请按照该仪器能设定的秒数设置（31秒，34秒等）。
三、结果分析：
反应结束后确认扩增曲线，进行定量时制作标准曲线等，分析方法参见仪器的操作手册。
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